Extracción de ADN
Extracción mediante el kit comercial INSTAGENE
Cada mesa dispone de una levadura (práctica VI) y una bacteria problema (práctica VIII). Las mesas pares utilizarán la levadura y las impares la bacteria correspondiente. En ambos casos, se selecciona una colonia del microorganismo desarrollado en un medio sólido y se resuspende en 1 mL de suero fisiológico estéril. Se agita fuertemente hasta conseguir una suspensión homogénea y se centrifugan a 3000‐5000 rpm durante 3‐5 minutos. Se retira el suero sobrenadante y nos quedamos con el precipitado de células. Cerrar y rotular adecuadamente el tubo.
Extracción de ADN :
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- Al precipitado que tenemos despues de centrifugar le añadimos 200 μL de solución de lisis (agitar previamente).
- Mezclar y poner a 56ºC durante 15 min.
- Pasado este tiempo agitar en el vórtex 10‐15 segundos por tubo
- Poner en un baño a 100ºC durante 8 minutos.
- Agitar de nuevo en vórtex 10‐15 segundos por tubo
- Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad.
- Usar el sobrenadante (es donde se encuentra el DNA) para la realización de la PCR o almacenar a ‐20ºC para usar más adelante.
Extracción mediante ciclos de temperatura
A partir de la placa de cultivo puro se cogerá una colonia bacteriana aislada. Tras marcarla con indeleble se procede a picar la colonia con el asa de siembra y pasar a un eppendorf con 100 μl de TE.
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- Incubar en baño a 95ºC durante 5 minutos
- Incubar en frío durante 1 minuto
- Vortex
- Incubar en frío durante 2-4 minutos
- Vortex
- Repetir todo el ciclo 2 veces más
- Centrifugar a 9500 rpm durante 5 minutos
- Recuperar 20 μl de la parte superior del sobrenadante y pasarlo a un nuevo eppendorf correctamente rotulado.
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