La piocianina es un pigmento azul-verdoso característico producido por la bacteria Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista muy importante en el ámbito clínico, especialmente en infecciones nosocomiales, fibrosis quística y pacientes inmunocomprometidos. Es un factor de virulencia clave y un compuesto redox-activo que confiere a P. aeruginosa una ventaja significativa en su supervivencia y patogenicidad.

Objetivos:

1. Cultivar Pseudomonas aeruginosa para inducir la producción de piocianina.
2. Observar y documentar la pigmentación característica de la piocianina en el medio de cultivo.
3. Realizar una extracción básica de la piocianina para confirmar su presencia y observar su cambio de color con el pH.
4. Comprender la importancia clínica de la piocianina como factor de virulencia.

Materiales:

• Cultivo puro de Pseudomonas aeruginosa
• Medios de cultivo: Agar de King B o Caldo de King B
• Material  básico de laboratorio
• Reactivos (para la extracción y cambio de pH):
  • Cloroformo (CHCl3)
  • Ácido clorhídrico (HCl) 0.2 M
  • Hidróxido de sodio (NaOH) 0.2 M

Procedimiento:

Parte 1: Inducción de la Producción de Piocianina en Cultivo Líquido y Sólido

1. Inoculación del medio de cultivo:
   • Medio sólido (Agar King B): Siembra por estría un cuadrante de una placa de Agar King B con una asada de P. aeruginosa de un cultivo fresco.
   • Medio líquido (Caldo King B): Inocula un tubo con Caldo King B con una asada de P. aeruginosa.
2. Incubación:
   • Incuba las placas y los tubos a 37°C durante 24-48 horas. La producción de piocianina es óptima en condiciones aeróbicas.
3. Observación de los resultados (24-48 horas después):
   • En agar: Observa el crecimiento de las colonias y la coloración azul-verdosa difusa que se extiende en el agar alrededor de las colonias.
   • En caldo: El caldo se tornará de un color azul intenso o azul-verdoso. Cuanto más denso sea el crecimiento y más tiempo de incubación (hasta 48-72h), más pronunciada será la pigmentación.

Parte 2: Extracción y Prueba de Solubilidad/Cambio de Color de la Piocianina

Esta parte demuestra las propiedades químicas de la piocianina y su distintivo cambio de color con el pH.

1. Recolección del sobrenadante:
   • En el tubo con Caldo King B que muestra una intensa pigmentación azul, centrifuga el cultivo a 8,000-10,000 rpm durante 10-15 minutos para sedimentar las células bacterianas.
   • Con cuidado, transfiere el sobrenadante pigmentado (líquido azul) a un nuevo tubo de ensayo estéril. Este sobrenadante contiene la piocianina soluble.
2. Extracción con cloroformo:
   • En un tubo de ensayo o un embudo de separación, añade un volumen igual o ligeramente inferior de cloroformo (CHCl3) al sobrenadante.
   • Mezcla vigorosamente agitando suavemente el tubo o invirtiendo el embudo de separación (liberando la presión periódicamente si usas embudo). La piocianina es soluble en cloroformo.
   • Deja reposar la mezcla hasta que las fases se separen. Observarás dos capas:
     • Una capa superior acuosa (generalmente incolora o ligeramente azul pálido).
     • Una capa inferior de cloroformo (azul intensa), donde se ha extraído la piocianina.
   • Retira cuidadosamente la capa de cloroformo azul a un nuevo tubo limpio. (¡Precaución: El cloroformo es tóxico y volátil, trabajar en campana de extracción!)
3. Prueba de cambio de color por pH:
   • Divide la capa de cloroformo azul en dos alícuotas en tubos de ensayo separados.
   • Alícuota 1 (control): No añadas nada.
   • Alícuota 2 (prueba de pH):
     • Añade unas gotas de HCl 0.2 M. Observa el cambio de color: la capa de cloroformo se volverá de un color rojo o rojizo. Esto demuestra que la piocianina es roja en medio ácido.
     • Luego, a esa misma alícuota, añade unas gotas de NaOH 0.2 M. Observa cómo el color vuelve a cambiar a azul a medida que el pH se torna alcalino.