Técnica de aislamiento y recuento: Banco de diluciones

Esta técnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y además el recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo inicial.

Se trabaja con cinco tubos con suero fisiológico estéril, uno de ellos con 10 ml y el resto con 9 ml, en el orden que se muestra en la figura. Mediante una micropipeta con una punta estéril tomar 1 ml del cultivo mixto y depositarlo en el primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta estéril y de este primer tubo transferir 0,1 ml al segundo tubo, agitar y repetir la operación transfiriendo 1ml del segundo al tercer tubo, del tercero al cuarto y del cuarto al quinto.

Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres últimos tubos (diluciones 104, 105 y 106) 0,1 ml en placas de agar nutritivo, mediante la técnica de siembra por extensión (ver video). Se depositan los 100 microlitros en la superficie del agar y se debe extender la muestra en toda la superficie del mismo, utilizando para ello el asa de vidrio.

Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea encendiéndola con la llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y abriendo la placa lo justo para introducir el asa, extender la muestra arrastrándola con

la base del triángulo por toda la superficie del medio hasta que éste absorba toda el agua. Incubar a 37ºC durante 24 horas y realizar el recuento de las colonias calculando la concentración de células en el tubo inicial mediante la fórmula:

ufc / ml = N x D x 10

Donde:

ufc = unidades formadoras de colonias
D = dilución
N = nº de colonias

Ejemplo de resultados tras la realización de un banco de diluciones

Recuento del número de colonias en las placas sembradas con las diluciones 104, 105 y 106, (para facilitar el recuento se utiliza un rotulador de vidrio punteando una a una cada colonia)

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